Chitosan in Mikrofluidik Systemen

In Mikrofluidik Systemen können Analysen im minituarisierten Maßstab ohne die Verwendung von aufwendigen Laborgerät durchgeführt werden. Dabei stellt die DNA Aufreinigung und Konzentrierung eine besondere Herausforderung dar. Um diese zu verbessern wird in der vorgestellten Studie ein Einwegmikrofluidik Gerät mit verschiedenen Chitosanen zur DNA Bindung funktionalisiert. Verwendet wird dieses anschließend für den Nachweis von eDNA invasiver Arten aus Flusswasserproben.

AUF DER SUCHE NACH DEM EINDRINGLING – WIE CHITOSAN IN MIKROFLUIDIK SYSTEMEN BEI DER ERKENNUNG INVASIVER ARTEN HELFEN KANN

Single-use microfluidic device for purification and concentration of environmental DNA from river water. Carvalho,J.; Di´eguez, L.; Ipatov, A.; Guerreiro, J.R..; Garrido-Maestu, A.; Azinheiro, S.; Prado, M.; Talanta 226 (2021) 122109

Die Einwanderung von invasiven Arten, wie die Süßwassermuschel Dreissena polymorpha, können verschiedene wirtschaftliche und umwelttechnische Probleme auslösen. Zum Beispiel verstopfen die sogenannten Zebramuscheln Abwasserrohre oder verdrängen einheimische Arten. Aus dem Grund ist es wichtig das Vordringen dieser rechtzeitig festzustellen. Nachweisen kann man diese zum Beispiel durch das vorhanden sein von sogenannter environmental DNA (eDNA). Bei eDNA handelt es sich um DNA die direkt aus Umweltproben wie Boden, Salz- oder Süßwasser gewonnen werden. Quellen dieser DNA sind z.B. Fäkalien, Kadaver, Keimzellen oder Hautschuppen.

Eine einfach handhabbare Methode zum Nachweis von DNA können DNA-basierte Mikro-total Analysensysteme (µTAS) sein. Miniaturisierte Analyseplattformen haben die Vorteile, dass sie z.B. tragbar und automatisierbar sind, keine aufwendigen Laborgeräte benötigen und eine geringere Gefahr von Kontaminationen besteht. Eine volle Integration aller Prozessschritte scheitert aber oft an der Probenvorbereitung. Vor allem durch die enorme Vielfältigkeit und Komplexität von Proben aus unterschiedlichen Quellen ist diese oft schwierig. Außerdem erschweren hoch fragmentierte DNA oder Kontaminationen den Prozess. Besonders bei der Identifizierung von Organismen über eDNA stellen die geringen Konzentrationen eine Herausforderung dar.

In dem vorgestellten Paper wurde ein Einwegmikrofluidik Gerät entworfen für die Reinigung und Konzentration von eDNA. Dafür wurde eine Mikrofluidikkammer entwickelt an der die DNA an Mikrosäulen aus PDMS (Polydimethylsiloxan) gebunden wurde. Um höhere Ausbeuten und eine pH-abhängige DNA Reinigung zu ermöglichen, wurden diese mit verschiedenen Chitosanen funktionalisiert. Durch die positive Ladung der primären Amine bei niedrigen pH (unter pKa 6,3-6,5) kann die negativ geladene DNA dort gut binden. Außerdem weisen Chitosane im Gegensatz zur Verwendung von Silica für die Konzentrierung von DNA den Vorteil auf, dass keine Reagenzien verwendet werden müssen die später die PCR stören. Insgesamt wurden dafür drei verschiedene Chitosane verwendet: Low Molecular Weight (LMW) Chitosan (MW 50-190 kDa; DD 75-85 %), Chitosan Laktat (MW ≤ 5 kDa; DD > 90 %), Chitosan Oligomer (MW ≤ 5 kDa; DD ≥ 75 %). Das Chitosan Oligomer stammte dabei von der Heppe Medical Chitosan GmbH. Neben der Art des Chitosans, wurden außerdem der Einfluss der verwendeten Konzentration und die Dauer der Funktionalisierung untersucht. Anschließend wurde das optimierte Mikrofluidik Gerät für die Detektion von eDNA von Dreissena polymorpha in Flusswasserproben getestet. 

Ergebnisse

• Die besten DNA Bindungskapazitäten wurden bei dem LMW Chitosan (89,6 %) und dem Chitosan Lactat (90,6 %) gefunden, das Chitosan Oligomer hat lediglich 30,4 % der eingesetzten DNA gebunden aufgrund seines geringen MW und DD
• Allerdings wurde dort die höchste Rückgewinnung von DNA beobachtet (12,6 %). (LMW Chitosan: 6,6 %, Chitosan Oligosaccarid Lactat: 10.1 %)
• Keine signifikante Änderung der DNA Ausbeute bei Verringerung der DNA Konzentration des LMW Chitosans von 1% auf 0,15 %
• Verringerung der DNA Bindung (von 90,6 % auf 64,1 %) und Rückgewinnung (von 10,1 % auf 4,1 %) bei reduzierter Chitosan Oligosaccarid Lactat Konzentration von 1% auf 0,15 % (w/v)
• Keine Verbesserung der DNA Bindungseffizienz bei Erhöhung der Chitosan Oligomer Konzentration (von 1 % auf 2 % (w/v))
• Keine Erhöhung der DNA Bindung für das Chitosan Oligonukleotid bei Erhöhung der Funktionalisierungsdauer von 1h auf über Nacht 
• Erfolgreicher Nachweis geringer Konzentrationen von eDNA von Dreissena polymorpha

Zusammenfassung: Die DNA Bindung und Rückgewinnung im mikrofluidischen System hängt stark von dem gewählten Chitosan ab. Aufgrund der hohen DNA-Ausbeute wurde das beste Ergebnis für 1% (w/v) Chitosan Oligomer mit 1 h Funktionalisierungszeit erzielt. Aus den Ergebnissen wurde gefolgert, dass für eine optimale DNA Konzentration mit Chitosanen ein Kompromiss zwischen guter Bindungsfähigkeit und Ausbeute gewählt werden sollte. Insgesamt gelang es mit diesem Ansatz, die DNA Konzentration in der Probe um das 20-fache zu erhöhen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass mit dieser Methode selbst stark verdünnte eDNA aus Flusswasserproben ohne vorherige Vorbehandlung gereinigt und konzentriert werden kann.